CpG-ODN对树突状细胞的分化成熟的影响
作者：王闻雅 于益芝 张明徽 刘书逊 厉永建 王宜强 曹雪涛
单位：王闻雅 于益芝 张明徽 刘书逊 厉永建 王宜强 曹雪涛(第二军医大学免疫学教研室 上海 200433)
关键词：树突状细胞；非甲基化CpG基序；寡核苷酸；分化；成熟
中国肿瘤生物治疗杂志000304 摘 要 目的： 探讨CpG-ODN对小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDC)分化成熟的影响。方法： 利用合成的含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG motif containing oligonucleotides，CpG-ODN)，通过 酶切鉴定DNA制品CpG基序甲基化程度,FACS 分析DC表型和内吞作用的变化,ELISA检测DC培养上清中IL-12,IL-6,IL-1β和TNF-α和NO的含量。结果： CpG-ODN能够刺激DC前体细胞增殖，提高DC MHCⅡ类分子、B7-2和CD40的表达，明显增加IL-12等细胞因子的分泌，显著增强DC刺激初始型T细胞增殖。结论： CpG-ODN与LPS一样能够促进DC成熟进而增强抗原提呈功能。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R392.12
Stimulatory Effect of CpG-ODN on the Differentiation and Maturation of Bone Marrow-Derived Dendritic Cells
Wang Wenya, Yu Yizhi, Zhang Minghui, Liu Shuxun, Li Yongjian, WangYiqiang, Cao Xuetao
(Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
Abstract Objective: To investgate the effect of immunostimulatory CpG-ODN on the differentiation, maturation of bone marrow-derived dendritic cells (BMDC). Methods: Methlylation of DNA was identifiedat by restrictive enzymes. The expression of surface molecules associated with antigen presentation on CpG-ODN-stimulated BMDC and antigen uptake of BMDC were analyzed by FACS analysis. Levels of immunoregulatory cytokines in supernatants were detected by ELISA. The stimulatory effect of CpG-ODN-activated DC on proliferation of allogeneic T lymphocytes was examined by [3H]-TdR incorporation. Results: CpG-ODN had significant effect on the proliferation of DC progenitor and could up-regulate expression of B7-2,CD40 and MHC classⅡon the immature and mature BMDC, However, ZpG-ODN or Non-ODN, which contained methylcytosine or GC motif instead of unmethlyated cytosine as part of the CpG-ODN, had little effect on BMDC. Besides, CpG-ODN-stimulated DC produced high levels of IL-12, IL-6 and IL-1βin the supernatants but little TNF-α. The proliferation of naive T cells induced by CpG-ODN-stimulated DC was significantly enhanced. FACS analysis showed that the endocytic capacity of CpG-ODN-stimulated DC weaken obviously. Conclusion: CpG-ODN,like LPS has remarkable stimulatory effect on DC differentiation, maturation and antigen-presenting function.
, 百拇医药
Key words dendritic cells; CpG motif; oligonucleotides; differentiation; maturation
树突状细胞(dendritic cells, DC)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)，在免疫反应中起着举足轻重的作用[1,2]。DC是否成熟对其功能的发挥十分重要。目前人们已发现了可以刺激DC成熟的多种因素，如LPS,TNF-α和CD40-CD40L等[3～5]，并且也在积极寻找新的刺激因素。近年来研究表明，细菌基因组DNA因含有非甲基化的CpG基序可以有效地活化APC，具有较强免疫刺激活性[6]。由于来自细菌的LPS具有明确的诱导DC成熟并影响其功能的作用，由此设想同样来自细菌的非甲基化CpG基序很可能对DC分化发育和功能有一定的影响。据此，本研究合成了含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG motif containing oligonucleotides，CpG-ODN)并提取了细菌DNA(E.coli.DNA, EC DNA)，研究了它们对小鼠骨髓来源的DC(bone marrow-derived DC，BMDC)分化发育的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂、动物和细胞株
基因工程小鼠GM-CSF由本室制备纯化(纯度98%，与mGM-CSF标准品对比,确定其比活性3×107 U/mg)，T细胞尼龙柱均购自Sigma公司；mIL-4、抗小鼠Iab-FITC，CD11c-PE，B7-2-PE，CD40-FITC购自PharMingen公司；小牛胸腺DNA(CT DNA)购自Sigma公司；小鼠细胞因子检测试剂盒购于Endogen 公司；[3H]-TdR购自Amersham公司；细菌脂多糖(LPS)和OVA-FITC购自Sigma公司。C57BL/6(H-2b)、BALB/c(H-2d)/c小鼠,雌性，6～8周龄，购自上海比凯实验动物有限公司。
1.2 细菌基因组DNA和寡核苷酸(ODN)的制备
, 百拇医药
1.2.1 大肠杆菌基因组DNA(E.coli.DNA)
制备方法见参考文献[7]。
1.2.2 人工合成的寡核苷酸(phosphorothioate oligonucleotides，S-ODN)
含有非甲基化的CpG 基序的寡核苷酸CpG-ODN (TCCATGACGTTCCTGATGCT)、不含CpG 基序的寡核苷酸Non-ODN(TCCATGAGCTTCCTGATGCT)以及含甲基化的CpG基序的寡核苷酸ZpG-ODN (TCCATGAmCGT TCCTGATGCT)均由赛百盛公司合成。所有碱基均硫代处理。
1.3 DNA制品甲基化分析
参考文献[8]方法。
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1.4 小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)体外培养扩增及鉴定
参考Inaba等方法[9]并稍加改进。无菌取 C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞，Tris-NH4Cl溶解红细胞，经大鼠抗小鼠CD4，CD8，B220/CD45RIa和FCR单抗及补体(10∶1稀释)介溶后的骨髓细胞(1×106/ml)在含有mGM-CSF(20 ng/ml)和mIL-4(1 ng/ml)的RPMI 1640完全培养基培养。第3天，吸弃培养基及悬浮细胞，补充新鲜培养基,mGM-CSF和mIL-4，继续培养至第4天收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，置新培养基过夜，收集悬浮细胞即为富集的第5天BMDC。所获DC经流式细胞仪(FACS calibur,B.D.公司)进行细胞表型分析鉴定。
1.5 DC细胞表型和内吞OVA-FITC的FACS分析
收集与ODN共同孵育18 h后的BMDC，加入抗小鼠Iab-FITC，CD11c-PE，B7-2-PE，CD40-FITC，终浓度5 μg/ml，置4℃标记45 min。流式细胞仪检测DC表面标志的几何平均数(Go mean)和百分数(Gate %)。
, 百拇医药
另取与ODN共同孵育18 h后的BMDC，置冰上预冷10 min后，加入预冷OVA-FITC (10 μg/ml)，置37℃，5%CO2孵育30 min，以流式细胞仪检测荧光程度。
1.6 不同ODN对BMDC的处理
收集第5天BMDC，铺于24孔培养板(1×106细胞/孔)，分别加入CpG-ODN及相应对照物至10 μg/ml，置37℃, 5%CO2孵箱培养18 h，收集各孔细胞和培养上清。细胞由FACS分析表面分子，培养上清检测IL-12(p70)，IL-6，TNF-α和IL-1β的分泌水平。
实验分组: ① CpG-ODN 10 μg/ml； ② ZpG-ODN 10 μg/ml； ③ Non-ODN 10 μg/ml； ④ EC DNA 10 μg/ml； ⑤ CT DNA 10 μg/ml； ⑥ LPS 1 μg/ml; ⑦ PBS空白对照。
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1.7 细胞因子的检测
收集BMDC的培养上清按ELISA试剂盒说明检测IL-12(p70)，IL-6，TNF-α和mIL-1β的水平。
1.8 BMDC培养上清中NO的含量测定
采用Griess试剂检测NO分泌的水平[11]。
1.9 不同ODN处理的DC刺激同种异体T细胞增殖反应的检测(MLR)
无菌制备BALB/c小鼠脾细胞悬液，采用尼龙毛柱过滤法分离T细胞，作为反应细胞；取经不同ODN处理18 h的第5天BMDC经4 000 rad放射线灭活后，作为效应细胞，效靶比为 100∶1，30∶1和10∶1。置37℃,5%CO2孵箱中培养96 h，于培养结束前18 h加入[3H]-TdR (l μCi/孔)。收集细胞,液闪计数仪检测cpm值，结果以3孔平均值表示。
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1.10 统计学分析
采用单因素方差分析，组间行q检验比较，P<0.05时具有显著性差异。
2 结 果
2.1 细菌基因组DNA的鉴定及其甲基化程度的分析
电泳结果显示，E.coli. DNA可被HpaⅡ酶顺利切割成小片段，而CT DNA因CpG基序多为甲基化而几乎不能被切割。由于DNA对HpaⅡ酶切割的敏感性能够反映其CpG基序的甲基化程度，结果表明，制备的EC DNA具有一定的非甲基化CpG基序。
2.2 CpG-ODN对BMDC培养早期的骨髓细胞的促增殖作用
CpG-ODN与富集的第4天BMDC 作用34 h，细胞增殖结果显示，CpG-ODN处理组的骨髓细胞增殖明显(P<0.01)，ZpG-ODN，Non-ODN共育的DC与空白对照比较，增殖程度无显著差别(P>0.05)(结果未显示)。提示CpG-ODN能够促进体外DC前体细胞的增殖。
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2.3 CpG-ODN 对BMDC表面标志的影响
结果显示(图1)，空白对照组BMDC(正常培养的第6天BMDC)MHCⅡ类分子(Iab)的表达并不均一，约50%未达到高表达，提示此时的DC并未完全成熟。与空白对照组相比，CpG-ODN处理18 h的BMDC细胞表面Iab，B7-2和CD40呈阳性的细胞数目明显增多(Go mean)，在这些DC标志分子呈阳性的细胞群中，高表达Iab，B7-2和CD40的平均荧光强度均明显增高(结果未显示)。CpG-ODN处理组效果与LPS组相当。ZpG-ODN和Non-ODN 处理组的表达无明显变化。提示CpG-ODN能够促进BMDC MHC-Ⅱ类分子Iab，B7-2，CD4的表达，成熟DC所占比例显著增多。
图1 CpG-ODN处理的BMDC表型的FACS分析
, http://www.100md.com
Fig.1 FACS analysis for surface molecules of
BMDC stimulated with CpG-ODN
2.4 CpG-ODN对BMDC分泌细胞因子的影响
正常培养的第6天BMDC分泌的IL-12，TNF-α，IL-6水平很低不超过(5±0.64) pg/ml, IL-1β分泌具有一定水平达(60±7.21) pg/ml。CpG-ODN刺激后的DC分泌IL-12,IL-6,TNF-α和IL-1β均明显增加，分别为(366.4±47.6) pg/ml, (298.1±44.7) pg/ml, (545.2±89.1) pg/ml和(601.3±70.4) pg/ml。TNF-α的增加不及LPS处理组明显，CpG-ODN诱导BMDC分泌IL-12的水平与LPS作用相近; CpG-ODN与LPS联合应用进一步促进IL-12 和TNF-α的分泌。ZpG-ODN和Non-ODN 处理组与对照组比较，相差不显著。结果未显示，CpG-ODN能够激活DC，分泌一些具有免疫调节作用的细胞因子。
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2.5 CpG-ODN对BMDC分泌NO的影响
正常空白对照组NO的水平很低,为(29±0.45) nmol/L；BMDC经CpG-ODN或LPS刺激后，其产生的NO显著增加，分别达到(1 466.1±24.7) nmol/L 和(1 628.7±26.9) nmol/L。ZpG-ODN和Non-ODN 处理组的BMDC上清中NO与对照组相比无显著性差别。结果提示，CpG-ODN能够刺激DC分泌NO。
2.6 CpG-ODN对BMDC内吞能力的影响
FACS分析结果显示(图2)，正常培养的第4天BMDC具有较强的内吞完整抗原的能力，CpG-ODN(10 μg/ml)刺激后的BMDC对OVA-FITC内吞明显减弱，与空白对照组相比，降低了44.8%；随着CpG-ODN 处理剂量的增加，DC内吞能力进一步降低。与空白对照相比，ZpG-ODN或Non-ODN处理组DC内吞抗原的能力无明显改变。结果提示，CpG-ODN诱导BMDC进入成熟状态，从而减弱了其内吞抗原的能力。
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图2 CpG-ODN对BMDC内吞OVA-FITC作用的影响
Fig.2 FACS analysis for OVA-FITC uptake by
BMDC cultured with CpG-ODN
2.7 CpG-ODN处理后的BMDC对同种异体T细胞增殖反应的影响
如图3所示，CpG-ODN 10 μg/ml处理组BMDC比正常对照组更显著地促进同种异体T淋巴细胞的增殖(P<0.01)，且作用与LPS(10 μg/ml)相当，高剂量100 μg/ml CpG-ODN处理后这种作用更强(P<0.01)；不同剂量的ZpG-ODN或non-ODN处理组与空白对照组无明显差别，提示GpG可增强DC的抗原提呈能力。
3 讨 论
, 百拇医药
髓系DC由前体分化发育为成熟DC (mature DC, DC)的过程中需经历一个未成熟的阶段。此阶段的未成熟的DC(immature DC,iDC)具有很强的内吞、处理完整抗原的能力，但细胞表面缺乏共刺激分子和粘附分子， MHC-Ⅱ类分子表达水平很低，激发同种T淋巴细胞反应(allo-MLR)的能力较弱；当iDC摄取抗原或接受某些刺激因素而发育成熟，成熟DC内吞处理完整抗原的能力减弱甚至消失，细胞表面高表达MHCⅡ类分子、共刺激分子和粘附分子, 获得极强的激发T淋巴细胞反应的能力[1]。在iDC成熟的过程中，相继发现 LPS，TNF-α和CD40/CD40L等能够促进DC成熟[4,5]。本研究结果表明，与LPS同样来自细菌的非甲基化CpG基序对DC分化、成熟以及功能有明显刺激作用，但与LPS的作用有一定的差异。
图3 CpG-ODN诱导BMDC对初始型细胞增殖的刺激作用
, 百拇医药
Fig.3 Stimulatory effect of CpG-ODN-activated BMDC on the proliferation of allogenic T lymphocytes
A： CpG(100 μg/ml)； B： CpG(10 μg/ml)
本研究中，观察CpG-ODN(10 μg/ml) 能够明显促进培养初期的DC前体细胞增殖。 培养第4天BMDC具有较强的内吞抗原的能力，经CpG-ODN处理后的DC对抗原的内吞作用明显减弱。与此同时，FACS检测结果表明，CpG-ODN处理后的DC MHC-Ⅱ类分子、共刺激分子和粘附分子表达水平明显上调;分泌IL-12，IL-6和IL-1β水平增高;刺激初始型T细胞增殖的能力显著增强。由此可见，CpG-ODN刺激DC由非成熟状态向成熟状态过渡，促使非成熟细胞成熟，加速了DC成熟的进程,并且激活成熟DC分泌IL-12，IL-6，IL-1β等细胞因子。
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此研究为更全面地了解CpG-ODN对DC激活作用提供了实验依据，其作用机制还在进一步研究之中。
本课题受高等学校优秀青年教师教学科研奖励(JRAPOYT)和上海市学科带头人计划(97XD406)资助
王闻雅,女,26岁,博士研究生,主要从事树突状细胞分化发育研究.
参 考 文 献
1，Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998, 39(6673): 245
2，曹雪涛. 树突状细胞基础与临床研究新进展. 中国免疫学杂志， 1998， 14(3)： 161
, 百拇医药 3，Weiner GJ, Liu HM, Wooldridge JE, et al. Immunost imulatory oli-godeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen mmunization. Proc Natl Acad Sci USA， 1997, 94: 10833
4，Herbst B, Kohler G, Mackensen A, et al. Lindemann A. CD34+ peripheral blood progenitor cell and monocyte derived dendritic cells: A comparative analysis. Br J Haematol， 1997, 99(3): 490
5，De Smedt T, Pajak B, Muraille E, et al. Regulation of dendritic cell numbers and maturation by lipopolysaccharide in vivo. J Exp Med， 1996, 184(4): 1413
, http://www.100md.com
6，Krieg AM, Yi AK, Schorr J, et al. The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines. Trends Microbiol， 1998, 6(1): 23
7，奥斯伯，金斯顿，塞德曼, 等著. 精编分子生物学实验指南/(美)F. 颜子颖，王海林译. 北京: 北京科学出版社, 1998. 35
8，Fernandez-Peralta AM, Navarro P, Tagarro I, et al. Digestion of human chromosomes by means of the isoschizomers Msp Ⅰ and HpaⅡ. Genome, 1994, 37(5): 770
(2000-03-25收稿； 2000-07-20修回), 百拇医药
单位：王闻雅 于益芝 张明徽 刘书逊 厉永建 王宜强 曹雪涛(第二军医大学免疫学教研室 上海 200433)
关键词：树突状细胞；非甲基化CpG基序；寡核苷酸；分化；成熟
中国肿瘤生物治疗杂志000304 摘 要 目的： 探讨CpG-ODN对小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDC)分化成熟的影响。方法： 利用合成的含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG motif containing oligonucleotides，CpG-ODN)，通过 酶切鉴定DNA制品CpG基序甲基化程度,FACS 分析DC表型和内吞作用的变化,ELISA检测DC培养上清中IL-12,IL-6,IL-1β和TNF-α和NO的含量。结果： CpG-ODN能够刺激DC前体细胞增殖，提高DC MHCⅡ类分子、B7-2和CD40的表达，明显增加IL-12等细胞因子的分泌，显著增强DC刺激初始型T细胞增殖。结论： CpG-ODN与LPS一样能够促进DC成熟进而增强抗原提呈功能。
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Stimulatory Effect of CpG-ODN on the Differentiation and Maturation of Bone Marrow-Derived Dendritic Cells
Wang Wenya, Yu Yizhi, Zhang Minghui, Liu Shuxun, Li Yongjian, WangYiqiang, Cao Xuetao
(Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
Abstract Objective: To investgate the effect of immunostimulatory CpG-ODN on the differentiation, maturation of bone marrow-derived dendritic cells (BMDC). Methods: Methlylation of DNA was identifiedat by restrictive enzymes. The expression of surface molecules associated with antigen presentation on CpG-ODN-stimulated BMDC and antigen uptake of BMDC were analyzed by FACS analysis. Levels of immunoregulatory cytokines in supernatants were detected by ELISA. The stimulatory effect of CpG-ODN-activated DC on proliferation of allogeneic T lymphocytes was examined by [3H]-TdR incorporation. Results: CpG-ODN had significant effect on the proliferation of DC progenitor and could up-regulate expression of B7-2,CD40 and MHC classⅡon the immature and mature BMDC, However, ZpG-ODN or Non-ODN, which contained methylcytosine or GC motif instead of unmethlyated cytosine as part of the CpG-ODN, had little effect on BMDC. Besides, CpG-ODN-stimulated DC produced high levels of IL-12, IL-6 and IL-1βin the supernatants but little TNF-α. The proliferation of naive T cells induced by CpG-ODN-stimulated DC was significantly enhanced. FACS analysis showed that the endocytic capacity of CpG-ODN-stimulated DC weaken obviously. Conclusion: CpG-ODN,like LPS has remarkable stimulatory effect on DC differentiation, maturation and antigen-presenting function.
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Key words dendritic cells; CpG motif; oligonucleotides; differentiation; maturation
树突状细胞(dendritic cells, DC)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)，在免疫反应中起着举足轻重的作用[1,2]。DC是否成熟对其功能的发挥十分重要。目前人们已发现了可以刺激DC成熟的多种因素，如LPS,TNF-α和CD40-CD40L等[3～5]，并且也在积极寻找新的刺激因素。近年来研究表明，细菌基因组DNA因含有非甲基化的CpG基序可以有效地活化APC，具有较强免疫刺激活性[6]。由于来自细菌的LPS具有明确的诱导DC成熟并影响其功能的作用，由此设想同样来自细菌的非甲基化CpG基序很可能对DC分化发育和功能有一定的影响。据此，本研究合成了含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG motif containing oligonucleotides，CpG-ODN)并提取了细菌DNA(E.coli.DNA, EC DNA)，研究了它们对小鼠骨髓来源的DC(bone marrow-derived DC，BMDC)分化发育的影响。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂、动物和细胞株
基因工程小鼠GM-CSF由本室制备纯化(纯度98%，与mGM-CSF标准品对比,确定其比活性3×107 U/mg)，T细胞尼龙柱均购自Sigma公司；mIL-4、抗小鼠Iab-FITC，CD11c-PE，B7-2-PE，CD40-FITC购自PharMingen公司；小牛胸腺DNA(CT DNA)购自Sigma公司；小鼠细胞因子检测试剂盒购于Endogen 公司；[3H]-TdR购自Amersham公司；细菌脂多糖(LPS)和OVA-FITC购自Sigma公司。C57BL/6(H-2b)、BALB/c(H-2d)/c小鼠,雌性，6～8周龄，购自上海比凯实验动物有限公司。
1.2 细菌基因组DNA和寡核苷酸(ODN)的制备
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1.2.1 大肠杆菌基因组DNA(E.coli.DNA)
制备方法见参考文献[7]。
1.2.2 人工合成的寡核苷酸(phosphorothioate oligonucleotides，S-ODN)
含有非甲基化的CpG 基序的寡核苷酸CpG-ODN (TCCATGACGTTCCTGATGCT)、不含CpG 基序的寡核苷酸Non-ODN(TCCATGAGCTTCCTGATGCT)以及含甲基化的CpG基序的寡核苷酸ZpG-ODN (TCCATGAmCGT TCCTGATGCT)均由赛百盛公司合成。所有碱基均硫代处理。
1.3 DNA制品甲基化分析
参考文献[8]方法。
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1.4 小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)体外培养扩增及鉴定
参考Inaba等方法[9]并稍加改进。无菌取 C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞，Tris-NH4Cl溶解红细胞，经大鼠抗小鼠CD4，CD8，B220/CD45RIa和FCR单抗及补体(10∶1稀释)介溶后的骨髓细胞(1×106/ml)在含有mGM-CSF(20 ng/ml)和mIL-4(1 ng/ml)的RPMI 1640完全培养基培养。第3天，吸弃培养基及悬浮细胞，补充新鲜培养基,mGM-CSF和mIL-4，继续培养至第4天收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，置新培养基过夜，收集悬浮细胞即为富集的第5天BMDC。所获DC经流式细胞仪(FACS calibur,B.D.公司)进行细胞表型分析鉴定。
1.5 DC细胞表型和内吞OVA-FITC的FACS分析
收集与ODN共同孵育18 h后的BMDC，加入抗小鼠Iab-FITC，CD11c-PE，B7-2-PE，CD40-FITC，终浓度5 μg/ml，置4℃标记45 min。流式细胞仪检测DC表面标志的几何平均数(Go mean)和百分数(Gate %)。
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另取与ODN共同孵育18 h后的BMDC，置冰上预冷10 min后，加入预冷OVA-FITC (10 μg/ml)，置37℃，5%CO2孵育30 min，以流式细胞仪检测荧光程度。
1.6 不同ODN对BMDC的处理
收集第5天BMDC，铺于24孔培养板(1×106细胞/孔)，分别加入CpG-ODN及相应对照物至10 μg/ml，置37℃, 5%CO2孵箱培养18 h，收集各孔细胞和培养上清。细胞由FACS分析表面分子，培养上清检测IL-12(p70)，IL-6，TNF-α和IL-1β的分泌水平。
实验分组: ① CpG-ODN 10 μg/ml； ② ZpG-ODN 10 μg/ml； ③ Non-ODN 10 μg/ml； ④ EC DNA 10 μg/ml； ⑤ CT DNA 10 μg/ml； ⑥ LPS 1 μg/ml; ⑦ PBS空白对照。
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1.7 细胞因子的检测
收集BMDC的培养上清按ELISA试剂盒说明检测IL-12(p70)，IL-6，TNF-α和mIL-1β的水平。
1.8 BMDC培养上清中NO的含量测定
采用Griess试剂检测NO分泌的水平[11]。
1.9 不同ODN处理的DC刺激同种异体T细胞增殖反应的检测(MLR)
无菌制备BALB/c小鼠脾细胞悬液，采用尼龙毛柱过滤法分离T细胞，作为反应细胞；取经不同ODN处理18 h的第5天BMDC经4 000 rad放射线灭活后，作为效应细胞，效靶比为 100∶1，30∶1和10∶1。置37℃,5%CO2孵箱中培养96 h，于培养结束前18 h加入[3H]-TdR (l μCi/孔)。收集细胞,液闪计数仪检测cpm值，结果以3孔平均值表示。
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1.10 统计学分析
采用单因素方差分析，组间行q检验比较，P<0.05时具有显著性差异。
2 结 果
2.1 细菌基因组DNA的鉴定及其甲基化程度的分析
电泳结果显示，E.coli. DNA可被HpaⅡ酶顺利切割成小片段，而CT DNA因CpG基序多为甲基化而几乎不能被切割。由于DNA对HpaⅡ酶切割的敏感性能够反映其CpG基序的甲基化程度，结果表明，制备的EC DNA具有一定的非甲基化CpG基序。
2.2 CpG-ODN对BMDC培养早期的骨髓细胞的促增殖作用
CpG-ODN与富集的第4天BMDC 作用34 h，细胞增殖结果显示，CpG-ODN处理组的骨髓细胞增殖明显(P<0.01)，ZpG-ODN，Non-ODN共育的DC与空白对照比较，增殖程度无显著差别(P>0.05)(结果未显示)。提示CpG-ODN能够促进体外DC前体细胞的增殖。
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2.3 CpG-ODN 对BMDC表面标志的影响
结果显示(图1)，空白对照组BMDC(正常培养的第6天BMDC)MHCⅡ类分子(Iab)的表达并不均一，约50%未达到高表达，提示此时的DC并未完全成熟。与空白对照组相比，CpG-ODN处理18 h的BMDC细胞表面Iab，B7-2和CD40呈阳性的细胞数目明显增多(Go mean)，在这些DC标志分子呈阳性的细胞群中，高表达Iab，B7-2和CD40的平均荧光强度均明显增高(结果未显示)。CpG-ODN处理组效果与LPS组相当。ZpG-ODN和Non-ODN 处理组的表达无明显变化。提示CpG-ODN能够促进BMDC MHC-Ⅱ类分子Iab，B7-2，CD4的表达，成熟DC所占比例显著增多。
图1 CpG-ODN处理的BMDC表型的FACS分析
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Fig.1 FACS analysis for surface molecules of
BMDC stimulated with CpG-ODN
2.4 CpG-ODN对BMDC分泌细胞因子的影响
正常培养的第6天BMDC分泌的IL-12，TNF-α，IL-6水平很低不超过(5±0.64) pg/ml, IL-1β分泌具有一定水平达(60±7.21) pg/ml。CpG-ODN刺激后的DC分泌IL-12,IL-6,TNF-α和IL-1β均明显增加，分别为(366.4±47.6) pg/ml, (298.1±44.7) pg/ml, (545.2±89.1) pg/ml和(601.3±70.4) pg/ml。TNF-α的增加不及LPS处理组明显，CpG-ODN诱导BMDC分泌IL-12的水平与LPS作用相近; CpG-ODN与LPS联合应用进一步促进IL-12 和TNF-α的分泌。ZpG-ODN和Non-ODN 处理组与对照组比较，相差不显著。结果未显示，CpG-ODN能够激活DC，分泌一些具有免疫调节作用的细胞因子。
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2.5 CpG-ODN对BMDC分泌NO的影响
正常空白对照组NO的水平很低,为(29±0.45) nmol/L；BMDC经CpG-ODN或LPS刺激后，其产生的NO显著增加，分别达到(1 466.1±24.7) nmol/L 和(1 628.7±26.9) nmol/L。ZpG-ODN和Non-ODN 处理组的BMDC上清中NO与对照组相比无显著性差别。结果提示，CpG-ODN能够刺激DC分泌NO。
2.6 CpG-ODN对BMDC内吞能力的影响
FACS分析结果显示(图2)，正常培养的第4天BMDC具有较强的内吞完整抗原的能力，CpG-ODN(10 μg/ml)刺激后的BMDC对OVA-FITC内吞明显减弱，与空白对照组相比，降低了44.8%；随着CpG-ODN 处理剂量的增加，DC内吞能力进一步降低。与空白对照相比，ZpG-ODN或Non-ODN处理组DC内吞抗原的能力无明显改变。结果提示，CpG-ODN诱导BMDC进入成熟状态，从而减弱了其内吞抗原的能力。
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图2 CpG-ODN对BMDC内吞OVA-FITC作用的影响
Fig.2 FACS analysis for OVA-FITC uptake by
BMDC cultured with CpG-ODN
2.7 CpG-ODN处理后的BMDC对同种异体T细胞增殖反应的影响
如图3所示，CpG-ODN 10 μg/ml处理组BMDC比正常对照组更显著地促进同种异体T淋巴细胞的增殖(P<0.01)，且作用与LPS(10 μg/ml)相当，高剂量100 μg/ml CpG-ODN处理后这种作用更强(P<0.01)；不同剂量的ZpG-ODN或non-ODN处理组与空白对照组无明显差别，提示GpG可增强DC的抗原提呈能力。
3 讨 论
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髓系DC由前体分化发育为成熟DC (mature DC, DC)的过程中需经历一个未成熟的阶段。此阶段的未成熟的DC(immature DC,iDC)具有很强的内吞、处理完整抗原的能力，但细胞表面缺乏共刺激分子和粘附分子， MHC-Ⅱ类分子表达水平很低，激发同种T淋巴细胞反应(allo-MLR)的能力较弱；当iDC摄取抗原或接受某些刺激因素而发育成熟，成熟DC内吞处理完整抗原的能力减弱甚至消失，细胞表面高表达MHCⅡ类分子、共刺激分子和粘附分子, 获得极强的激发T淋巴细胞反应的能力[1]。在iDC成熟的过程中，相继发现 LPS，TNF-α和CD40/CD40L等能够促进DC成熟[4,5]。本研究结果表明，与LPS同样来自细菌的非甲基化CpG基序对DC分化、成熟以及功能有明显刺激作用，但与LPS的作用有一定的差异。
图3 CpG-ODN诱导BMDC对初始型细胞增殖的刺激作用
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Fig.3 Stimulatory effect of CpG-ODN-activated BMDC on the proliferation of allogenic T lymphocytes
A： CpG(100 μg/ml)； B： CpG(10 μg/ml)
本研究中，观察CpG-ODN(10 μg/ml) 能够明显促进培养初期的DC前体细胞增殖。 培养第4天BMDC具有较强的内吞抗原的能力，经CpG-ODN处理后的DC对抗原的内吞作用明显减弱。与此同时，FACS检测结果表明，CpG-ODN处理后的DC MHC-Ⅱ类分子、共刺激分子和粘附分子表达水平明显上调;分泌IL-12，IL-6和IL-1β水平增高;刺激初始型T细胞增殖的能力显著增强。由此可见，CpG-ODN刺激DC由非成熟状态向成熟状态过渡，促使非成熟细胞成熟，加速了DC成熟的进程,并且激活成熟DC分泌IL-12，IL-6，IL-1β等细胞因子。
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此研究为更全面地了解CpG-ODN对DC激活作用提供了实验依据，其作用机制还在进一步研究之中。
本课题受高等学校优秀青年教师教学科研奖励(JRAPOYT)和上海市学科带头人计划(97XD406)资助
王闻雅,女,26岁,博士研究生,主要从事树突状细胞分化发育研究.
参 考 文 献
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4，Herbst B, Kohler G, Mackensen A, et al. Lindemann A. CD34+ peripheral blood progenitor cell and monocyte derived dendritic cells: A comparative analysis. Br J Haematol， 1997, 99(3): 490
5，De Smedt T, Pajak B, Muraille E, et al. Regulation of dendritic cell numbers and maturation by lipopolysaccharide in vivo. J Exp Med， 1996, 184(4): 1413
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7，奥斯伯，金斯顿，塞德曼, 等著. 精编分子生物学实验指南/(美)F. 颜子颖，王海林译. 北京: 北京科学出版社, 1998. 35
8，Fernandez-Peralta AM, Navarro P, Tagarro I, et al. Digestion of human chromosomes by means of the isoschizomers Msp Ⅰ and HpaⅡ. Genome, 1994, 37(5): 770
(2000-03-25收稿； 2000-07-20修回), 百拇医药